Hướng dẫn cách đọc kết quả trên kit thử ELISA

Trong bài “Kỹ thuật phân tích trên ELISA” đã đề cập đến khái niệm ELISA và phân loại ELISA. Trong khuôn khổ bài viết này, tôi sẽ hướng dẫn các bạn cách phân tích một hợp chất trên kit thử ELISA.

Hiện nay việc sử dụng kit thử ELISA để phân tích các hợp chất cần tìm được sử dụng rất phổ biến, đặc biệt trong lĩnh vực phân tích thực phẩm.

loading...

Ví dụ phân tích các chất trong nhóm kháng sinh như: Chloramphenicol, nitrofurans, Quinolones…

Phân tích các chất trong nhóm hóc môn như beta Agonist (Salbutamol, Clenbuterol)

Phân tích các chất là độc tố sinh học: Histamine, độc tố PSP…

Phân tích các chất nhóm thuốc nhuộm như: Malachite Green…

Có rất nhiều hãng sản xuất kit thử ELISA như các hãng R-Biopharm; Euro Diagnostica; BioScientific; Randox; Abraxis; TABP… để chúng ta lựa chọn. Các kit thử đều có hướng dẫn sử dụng rõ ràng, đầy đủ. Các bước tách chiết mẫu đơn giản, dễ thực hiện. Trong kit thử đều thể hiện rõ giới hạn phát hiện (limit of detection) hoặc độ nhạy (sensitivity) và độ thu hồi (recovery), ngoài ra còn có các thông số khác… Vậy khi PTN có kit thử ELISA thì làm thế nào để đọc được kết quả ? Hay nói cách khác khi kiểm nghiệm viên đã làm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất kit thử, nhưng trả kết quả phân tích trên ELISA cho một mẫu cụ thể là như thế nào?

Để trả lời câu hỏi trên, trước hết các bạn cần phải biết nguyên tắc tính toán và trả kết quả bằng kit thử ELISA của nhà sản xuất như thế nào.

Đọc kết quả trên kit thử ELISA, dựa trên nguyên tắc của kit thử. Có 2 trường hợp:

Trường hợp 1: Kit thử ELISA sử dụng phương pháp “cut off”.

Tức là hướng dẫn của nhà sản xuất kit thử chỉ hướng dẫn thực hiện phân tích mẫu negative và mẫu positive. Như vậy kết quả phân tích được đánh giá bằng cách so sánh với mẫu negative và mẫu positive qua giá trị độ hấp thụ (OD). Thông thường với các kit thử, mẫu có hàm lượng chất phân tích càng cao thì giá trị OD càng nhỏ. Do vậy trong trường hợp này, nếu mẫu phân tích có giá trị OD nhỏ hơn giá trị OD của mẫu positive thì mẫu đó được kết luận là dương tính.

Trường hợp 2: Kit thử ELISA của nhà sản xuất trả kết quả định lượng.

Ví dụ kit thử phân tích hàm lượng Furazolidone (AOZ). Hướng dẫn của nhà sản xuất công bố limit of detection (LOD – giá trị giới hạn phát hiện) trong tôm là 0,1 µg/kg (ppb). Đường chuẩn được xây dựng trên 6 điểm chuẩn ở các nồng độ: 0; 0,05; 0,15; 0,5; 1,5 và 4,5 ppb. Tuy nhiên đây là giới hạn phát hiện được công bố bởi nhà sản xuất kit thử với nền mẫu tại nơi mà nhà sản xuất lấy và phân tích và các điều kiện chuẩn của nhà sản xuất. Vì vậy, trước khi sử dụng, bạn cần phải kiểm tra lại giới hạn phát hiện và bạn phải tự công bố giới hạn phát hiện của PTN bạn làm việc vì nền mẫu và điều kiện phân tích của bạn khác với của nhà sản xuất kit thử. Giới hạn phát hiện của bạn thường lớn hơn hoặc bằng giới hạn phát hiện của nhà sản xuất đã công bố. Đây là một trong những nội dung cần thực hiện mà PTN của bạn bắt buộc phải làm trước khi đưa kit thử ELISA vào việc phân tích mẫu thực tế, gọi là “phê duyệt phương pháp” hoặc “xác nhận giá trị sử dụng phương pháp”.

Quay trở lại với việc xác định giới hạn phát hiện cho PTN. Trước tiên bạn phải tìm mẫu âm tính của AOZ, hay còn gọi là mẫu trắng, tức là mẫu không chứa chất cần phân tích AOZ. Tiến hành phân tích ít nhất khoảng 7 mẫu trên cùng một đối tượng mẫu, ví dụ mẫu tôm. Sau khi tiến hành phân tích, cho 7 kết quả khác nhau. Bạn cần tính giá trị trung bình (Xtb) của 7 kết quả đó và giá trị giới hạn phát hiện (lý thuyết) được tính theo công thức:

LOD = 3* Xtb

Ví dụ Xtb = 0,057 ppb     –>    LOD = 3* 0,057 = 0,171ppb

Như vậy giá trị LOD lý thuyết đã được xác định là 0,171 ppb. Tiếp theo bạn cần tiến hành kiểm tra lại giá trị LOD đó bằng cách thêm chuẩn AOZ vào trong mẫu trước khi tiến hành phân tích và phân tích lặp lại ít nhất 7 lần. Vì kit thử ELISA vô cùng đắt và để làm tròn, bạn nên xác định giá trị LOD tại giá trị 0,2 ppb.

Sau khi có kết quả phân tích của mẫu thêm chuẩn tại giá trị 0,2 ppb. Các kết quả phân tích thu được đều phải lớn hơn giá trị của mẫu trắng. Độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn tại giá trị 0,2ppb phải nằm trong khoảng cho phép đã được công bố bởi nhà sản xuất kit thử. Như vậy, có thể kết luận, giá trị giới hạn phát hiện của kit thử AOZ trên ELISA tại PTN của bạn là 0,2ppb. Các kết quả phân tích của mẫu thử ≥ 0,2 ppb (LOD) được trả bằng con số. Các kết quả phân tích của mẫu thử < 0,2 ppb (LOD) được kết luận là không phát hiện.

Trên đây chỉ giới thiệu cách xác định giới hạn phát hiện của kit thử ELISA tại PTN, cách đọc và trả kết quả đơn giản nhất. Đây chỉ là một phần của nội dung “Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp” mà PTN cần phải thực hiện để đạt được ISO 17025 và để được VILAS công nhận hợp chuẩn ISO 17025.

Cần phải nói rằng ELISA chỉ là phương pháp sàng lọc và mặc dù nó có thể định lượng được chất cần phân tích nhưng phương pháp phân tích trên ELISA không phải là phương pháp khẳng định. Tức là nó có thể âm tính giả hoặc dương tính giả. Vì vậy khi ELISA cho kết quả dương tính (tức là > LOD), nhưng để kết luận chính xác thì mẫu đó cần phải được kiểm khẳng định lại bằng các thiết bị định lượng như HPLC, LC-MS/MS; GC-MS…

(Nếu có thêm thắc mắc, bạn có liên hệ với chúng tôi để được giải đáp cụ thể).

Gửi phản hồi

Website này sử dụng Akismet để hạn chế spam. Tìm hiểu bình luận của bạn được duyệt như thế nào.